Tutkijajoukko osoittaa: SARS-coV-2 viruksen diagnosointiin käytetty RT-qPCR-testi on epäluotettava

 

Käytännössä kaikkialla maailmalla käytetään tällä hetkellä SARS-Cov-2 virusinfektion (tuttavallisemmin korona) diagnosoitiin RT-qPCR (Reverse Transcription quantitative Polymerase Chain Reaction) -menetelmää (eli se PCR), joka perustuu Corman-Drosten ym. tammikuussa 2020 Eurosurvaillence -lehdessä julkaisemaan tutkimukseen (1).

Marraskuussa 2020 julkaistiin review -raportti, jossa 22 toisistaan riippumatonta tutkijaa analysoivat tämän Corman-Drosten ym. julkaisun, ja esitttelevät kymmenen merkittävää virhettä (2), joiden vuoksi kyseinen PCR-menetelmä ei sovellu käytettäväksi uuden koronaviruksen diagnosoinnissa.

– HUOM! Voit lukea raportin laajemman käännöksen täällä. 

Kaikki tässä kirjoituksessani esitetty tieto on peräisin tuosta review artikkelista (2). Käyn kuitenkin ensin lyhyesti läpi tämän RT-qPCR -menetelmän perusperiaatteen.

 

RT-qPCR= Reverse Transcriptase quantitative Polymerase Chain Reaction

PCR on menetelmä, jossa kemiallisesti pystytään monistamaan DNA-näytteestä tietty, etukäteen tunnettu, geenialue. Kun pyritään osoittamaan SARS-cov-2 virusta potilasnäytteestä, eristetään näytteestä ensin viruksen RNA. Seuraavaksi valmistetaan RNA:ta mallina käyttäen vastaava ns. cDNA (complementary DNA), jota sitten puolestaan käytetään mallina halutun geenialueen monistamiselle.

SARS-cov-2 virusta osoittavaan testiin on valittu 2 tai 3 (testin valmistajasta riippuen) geenialuetta, joita pyritään monistamaan. Näiden alueiden päistä on valittu lyhyet geenisekvenssit, joita vastaavia DNA-pätkiä kutsutaan alukkeiksi eli primereiksi. Monistusreaktiossa kaksisäikeinen DNA ensin avataan, sen jälkeen annetaan alukkeiden sitoutua monistettavan geenialueen päihin yksisäikeisessä DNA:ssa ja lopuksi syntetisoidaan alukkeiden väliin jäävä alue entsyymin avulla. Tätä monistussykliä, eli DNA:n avaus-alukkeiden sitoutuminen-syntetisointi toistetaan sitten tietty määrä, esimerkiksi 30 kertaa. Syklien edetessä alukkeiden välinen DNA-alue monistuu eksponentiaalisesti.

Edellä mainitun lisäksi qPCR-menetelmässä tarvitaan koetin (probe). Se on monistettavaan alueeseen sitoutuva lyhyt DNA-pätkä, johon on liitetty flueresoiva merkkiaine. Kun entsyymi synteesivaiheessa tulee koettimen kohdalle, se purkaa koettimen tieltään ja vapauttaa fluoresoivan aineen. Näin ollen, mitä enemmän reaktioliuos fluoresoi, sitä enemmän monistettua geenipätkää se sisältää. Tästä tulee menetelmän nimi quantitative eli kvantitatiivinen. Fluoresenssin lisääntymistä reaktiosyklien edetessä voidaan seurata analyysilaitteiston piirtämästä kuvaajasta.

Review artikkeli Corman-Drosten ym. Eurosurveillance 2020, Kymmenen suurta virhettä

1) Menetelmässä on käytetty alukkeille poikkeuksellisen suuria pitoisuuksia reaktioseoksessa. Kun normaalisti luotettavissa ja tarkoissa PCR -protokollissa käytettävät pitoisuudet ovat 100-200 nmol/L, on Corman-Drosten ym. ym. menetelmässä käytetty jopa 600-800 nmol/L pitoisuuksia. Kuvatut pitoisuudet johtavat lisääntyneeseen alukkeiden epäspesifiseen sitoutumiseen ja PCR-tuotteiden monistumiseen, mikä tekee testistä soveltumattoman SARS-cov-2 viruksen tunnistamiseen.

2) Alukkeiden ja koettimen sekvensseissä (=DNAn emäsjärjestys) on kuusi ns. wobbly (suom. huojuva) paikkaa, eli emästä joita ei ole tarkasti määritelty. Tämä tarkoittaa että noissa kohdin DNA -ketjussa voi olla useampi kuin yksi neljästä emäksestä (A,C,G,T). Tämä aiheuttaa valtavan suurta vaihtelua testin käyttöön tosielämässä, sillä Corman-Drosten ym. eivät ole määritelleet testille stadradiprotokollaa (Standard Operational Protocol), eli yksiselitteisiä parametreja joilla testi suoritetaan. Testi ei siis sovellu spesifiseksi diagnostiseksi työkaluksi SARS-cov2 viruksen tunnistamiseen.

3) Testi ei pysty erottamaan toisistaan kokonaista virusta ja viruksen fragmentteja. Testi ei siis pysty osoittamaan onko näytteessä infektiokykyisiä viruksia, eikä se siten sovellu diagnostiseksi menetelmäksi SARS-coV-2 viruksen tunnistamiseen tai infektion osoittamiseen.

4) Ensimmäisen alukepari kiinnittymislämpötiloissa (ns. annealing lämpötila, jossa aluke kiinnittyy yksisäikeiseen DNA:han) on 10 °C ero. Normaalisti PCR testissä alukeparin annealing lämpötilojen tulisi erota korkeintaan 2 °C toisistaan. Myös tämän vuoksi testi ei sovellu SARS-coV-2 viruksen spesifiseen diagnosointiin.

5) Testille ei ole määritelty Ct arvoa (Cycle treshold), eli monintussyklien määrää, jossa näyte todetaan positiiviseksi tai negatiiviseksi. Tämä tekee testin käyttämisestä eri laboratorioissa sekavaa, jos tuloksia tulkitaan eri tavalla laboratoriosta riippuen. Korkeilla syklimäärillä (>35) mikä tahansa näyte voi antaa positiivisen tuloksen, siksi raja positiivisen ja negatiivisen tuloksen kohdalle pitäisi vetää yksiselitteisesti ja alemmille kierrosmäärille. Tämän vuoksi testi ei sovellu SARS-coV-2 viruksen diagnostiseen osoittamiseen.

6) PCR -tuotteita ei ole validoitu molekyylitasolla. Eli käytännössä Corma-Drosten ym. eivät ole osoittaneet, että PCR-menetelmällä monistetut tuotteet olisivat peräisin kyseiseltä SARS-coV-2 geenialueilta. Näin ollen monistustuotteissa voi olla muitakin, epäspesifisen monistumisen tuloksena syntyneitä DNA-pätkiä. Tämä tosiasia tekee testistä käyttökelvottoman SARS-coV-2 viruksen tunnistamisessa.

7) Testi ei sisällä uniikkia positiivista kontrollia, jolla voitaisiin arvioida sen spesifisyyttä SARS-coV-2 virukselle, eikä myöskään negatiivista kontrollia, jolla voitaisiin poissulkea muiden koronavirusten läsnäolo. Näin ollen testi ei sovellu SARS-coV-2 viruksen spesifiseen diagnosointiin.

8) Testiasetelma Corma-Drosten ym. julkaisussa oli niin epämääräinen ja virheellinen, että sen pohjalta voidaan päätyä lukemattomiin erilaisiin testiolosuhteisiin: mitään ei oltu standardisoitu eikä standardi protokollaa ollut määritelty. Tämä asettaa testin tieteellisen laadun kyseenalaiseksi ja tekee siitä soveltumattoman SARS-coV-2 viruksen spesifiseen diagnosointiin.

9) Mitä todennäköisimmin Corman-Drosten ym. julkaisua ei oltu vertaisarvioitu, joten testi ei sovellu SARS-coV-2 viruksen spesifiseen diagnosointiin.

10) Vähintäänkin neljällä Corman-Drosten ym. julkaisun kirjoittajista on vakavia eturistiriitoja. Esimerkiksi Christian Drosten ja Chantal Reusken istuvat itse Eurosurveillance lehden julkaisutoimikunnassa.

Lyhyenä yhteenvetona voidaan siis todeta, että kyseinen testi on hyvin puutteellisesti suunniteltu ja testattu. Lisäksi siitä tehtyä tieteellistä julkaisua ei ole vertaisarvioitu ja sen tekijöillä on huomattavia eturistiriitoja, joista ei ole julkaisussa mainittu. Testi on siis käyttökelvoton SARS-coV2 infektion diagnosoinnissa.

Lähteet:
(1) https://www.eurosurveillance.org/content/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

(2) https://cormandrostenreview.com/

 

Artikkeli on alunperin julkaistu Kristallipuolueen blogissa 19.12.2020.